A traditional medicine, respiratory detox shot (RDS), inhibits the infection of SARS-CoV, SARS-CoV-2, and the influenza A virus in vitro
Brian Hetrick1, Dongyang Yu2, Adeyemi A. Olanrewaju1, Linda D. Chilin1, Sijia He1, Deemah Dabbagh1,Ghaliah Alluhaibi1, Yuan - Chun Ma3, Lewis A. Hofmann4, Ramin M. Hakami1 and Yuntao Wu1*
▋摘要
历史背景：迄今为止正肆虐全世界的最初型冠状传染眼疾 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国际组织和内陆地区大风行，截至 2021 年 4 同年已导致；也过 1.28 亿人传染，；也过 280 万人致死。局限特质，尚无可必要减小 COVID-19 窒息率的疗法最初方法。我们学术研究了一种传统习俗的中所药静脉注射静脉注射——破除肺毒静脉注射液 (RDS) 的潜在炎冠状传染能活特质，该静脉注射液主要结合物为最初同年中医传统习俗中所用做疗法肺脏疾眼疾的中所精油。
结果：RDS 抑制 SARS-CoV 快传染、SARS-CoV-2 快传染、结合丙型传染-SARS-CoV-2(Ha-CoV-2) 假型传染以及传染特质 SARS-CoV-2 和相异的 Ha-CoV-2 兰花传染 (B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429、B.1.2、B.1.494、B.1.1.207、B.1.258 和 B.1.1.298) 对生物膜会的传染。我们更进一步断定了 RDS 可以反之亦然灭能活 SARS-CoV-2 传染微粒的传染特质。此外，我们找到 RDS 还可堵塞丙型风行特质感冒传染对生物膜会的传染。
正确特质：RDS 可尤其抑制黏膜传染传染。网易：SARS-CoV-2，COVID-19，冠状传染，炎传染疗法，破除肺毒静脉注射液，传统习俗中所药，SARS-CoV，丙型风行特质感冒，Ha-CoV-2，SARS-CoV-2 假型传染
▋历史背景
迄今为止正肆虐全世界的最初型冠状传染眼疾 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个国际组织和内陆地区大风行，截至 2021 年 4 同年已导致；也过 1.28 亿人传染，；也过 280 万人致死。局限特质，尚无可必要减小 COVID-19 窒息率的疗法最初方法。最初显现出现的 COVID-19 传染眼疾原体为冠状传染 SARS-CoV-2[1]，是 SARS-CoV 在导致急特质排便综合征特别冠状传染种类中所的兄妹传染[2,3]。SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 最初都是在中所国找到的；SARS-CoV 传染于 2002 年 11 同年在广东省首次被找到[4-6]，SARS-CoV-2 则于 2019 年 12 同年在武汉首次被找到[1,7,8]。在中所国，这两次由冠状传染惹来的禽风行特质感冒中所，中所药均被尤其应用于，借以即时毕竟冠状传染惹来的疾眼疾。对于局限特质的 COVID-19 大风行，中所国有；也过 85% 的 SARS-CoV-2 传染患者接受了传统习俗中所医药疗法（9，10）。许多应用于的中所药到底不具备必要的炎冠状传染特特质并在临床研究上到底必要，这个重要问题尚未取得充分请示。
中所药作为疗法冠状传染所引发疾眼疾的必要疗法，但由于忽视体内或粘液的系统学术研究，其发展与前提应用于均受到了受阻。为了已确定中所药的潜在炎 SARS-CoV-2 能活特质，我们从类似于中所药中所选取了多种精油杀菌剂，并从中所药静脉注射液 RDS(澳大利亚一种同类型食品阿斯巴甜) 中所找到了炎 SARS-CoV 和炎 SARS-CoV-2 传染的能活特质，一种在澳大利亚的娱乐业食品阿斯巴甜。RDS 用做请于强人体消化道的整体而言健康，其特别联多种精油结合物，如当归和麦冬，它们是传统习俗上用做控制瘙痒和肺脏疾眼疾的中所精油 (11-13)。在此，我们报道 RDS 对 SARS-CoV、SARS-CoV-2 假传染以及不具备传染特质的野生型 SARS-CoV-2 传染对生物膜会的传染不具备组胺。我们更进一步断定 RDS 可通过反之亦然灭能活传染微粒或阻挠传染侵入而抑制传染的一时期传染延迟。此外，我们找到 RDS 还可以阻挠的大流传染对生物膜会的传染。这些得出，RDS 对黏膜传染的传染意味著不具备尤其的组胺。
▋结果
为了从传统习俗中所精油中所找到潜在的炎 SARS-CoV-2 能活特质，我们从一共约四十种传统习俗精油中所选取提取显现出 SARS-CoV-2S 亚基假型快传染[14,15] 和人体肺脏 A549(ACE2) 生物膜会，此生命 ACE2 基因会通过快传染转导作为多肽介导，从而稳定转导来解决问题；也解读。快假型传染应用于绿色荧光亚基 (GFP) 或荧光芝酶 (Luc) 作为报道基因，并通过了不具备广谱炎传染进入抑静脉注射，以及的卡多尔 (Arbidol)[16]，和生命炎毒血清对炎 SARS-CoV-2(所示 1a、C) 的测试。我们尽意味著失败监测到的卡多尔 (Arbidol) 和炎毒血清对于 SARS-CoV-2 假型传染的组胺，这是我们在其他四十余种传统习俗精油杀菌剂试验车中所并未找到的，特别联其中所一些依赖于极高疗效的精油 (所示 1a-C)。然而，鉴于快特质假型传染均能监测 SARS-CoV-2 传染的侵入行为，我们不能也就是说这些精油杀菌剂意味著有在进入后阶段尽意味著抑制 SARS-CoV-2 的意味著特质。我们更进一步从传统习俗抑静脉注射破除肺毒静脉注射液 (RDS) 中所选取显现出了意味著的炎 SARS-CoV-2 能活特质，该产品成分可分精油结合物——、人参、当归、麦冬、老鹳草、苦杏仁、蜂房、皂角、生姜，在中所国传统习俗上用做疗法肺脏疾眼疾 (11-13)。
成分的大基冰淇淋硫酸、3，4-二邻冰淇淋亚胺苯的大硫酸硫酸、的大基 3，4-二邻冰淇淋亚胺苯的大硫酸硫酸、原儿茶硫酸、的大基绿原硫酸和木犀草芝；花蕾中所还成分氨酸 A、B 和 10 种已已确定环烯醚萜氨酸[17]；该真菌还成分皂甙甙 A 和 B，以及炎瘙痒发挥作用的氨酸 C[18,19]。人参酯氨酸中所成分木脂芝、松脂酰和人参氨酸[20]。当归中所成分被统称当归皂氨酸的甾体皂氨酸，是当归属下真菌独有的真菌有机物[21,22]。榕麦冬中所主要能活特质结合物为四种单萜，(−)-薄荷酮、(+)-普博梅斯酮、(−)-柠檬烯和 (+)-薄荷呋喃；这种真菌还成分其他有机化合物，如 1-辛烯-3-酰、3-辛酮、β-同年桂烯和β-鸭跖草烯[23]。老鹳草成分；也过 162 种有机化合物，特别联环烯醚萜和环烯醚萜氨酸、苯丙氨酸、有机硫酸、人参、糖类、抗氧化剂、和皂氨酸[24]。苦杏仁中所成分酚类、乙烯有机化合物和果胶糖类[25]。皂角刺中所成分皂氨酸和羽扇豆硫酸[26,27]，而生姜中所成分主要能活特质结合物生姜硫酸[28]。为了更进一步试验车 RDS 的炎 SARS-CoV-2 能活特质，用多种不同挥发硫酸度的 RDS 函数调用 A549(ACE2) 细胞会，然后让这些细胞会在依赖于 RDS 的才会接受 4-6 足足的传染。传染后，在不依赖于 RDS 的才会人才细胞会，然后在 48 和 72 足足的时候，通过流结构设计细胞会拳法对传染传染的组胺进行时举例来说。为了控制细胞会疗效，应用于氯化丙啶 (PI) 对刚致死和已致死的细胞会进行时上色，均在能活细胞会群中所归纳 GFP+细胞会。如所示 2 右所示，我们辨别到 RDS 对 SARS-CoV-2(GFP) 假传染不具备静脉注射抑制组胺。为了声称这些结果，我们应用于催化发挥作用解读 ACE2 的 VeroE6 细胞会反复了该传染试验车中所。
(可知下页所示)
ACE2 之外解读，反观 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 传染可对其进行时传染，ACE2 多半用做冠状传染的学术研究 (7)。毕竟在忽视 ACE2 ；也解读 [15，29，30] 的才会，假型传染对 VeroE6 的传染特质很低，我们还应用于了荧光芝酶报道基因假型传染，该传染的报道基因解读由 HIV-1LTR 和 Tat 转子，不具备更高的报道基因敏感特质和信噪比。
所示 2：RDS 抑制 SARS-CoV-2(GFP) 假型传染传染 A549(ACE2) 细胞会。
A.A549(ACE2) 细胞会用 RDS 同年份挥发 30 分钟后，用 SARS-CoV-2(GFP) 假型传染传染。将细胞会洗涤去传染和 RDS，并在不依赖于 RDS 的才会进行时人才。流结构设计细胞会祯监测传染传染抑制上述情况。未传染的细胞会和传染 SARS-CoV-2(GFP) 但未经 RDS 疗法的细胞会作为对照。GFP+细胞会百分比已辨识。(PI) 氯化丙啶。
B.RDS 的细胞会疗效一原理。A549(ACE2) 细胞会用 RDS 同年份挥发 4 足足，洗涤去 RDS，无 RDS 人才 48 足足。氯化丙啶上色认定正试图致死细胞会和已致死细胞会，流结构设计细胞会拳法归纳。绘所示静脉注射-化学反应细胞会疗效曲面，RDS 的半窒息硫酸度 (LC50) 比例为 1:11.9。
如所示 3A 右所示，我们应用于 Luc 报告基因假传染和 VeroE6 细胞会进行时传染试验车中所，辨别到 RDS 对该传染传染不具备静脉注射抑制组胺，并且半数抑制硫酸度已确定为 1:230RDS 挥发度 (所示 3B)。我们还举例来说了 RDS 对 VeroE6 细胞会能朝气的影响，已确定了 50% 细胞会致死静脉注射为 1:11.8RDS 挥发度。
所示 3：RDS 对 SARS-CoV-2(Luc) 假传染和野生型 SARS-CoV-2 传染的静脉注射抑制抑制组胺。用 RDS 同年份挥发函数调用 A、BVeroE6 细胞会，他用 SARS-CoV-2(Luc) 假型传染传染。将细胞会洗涤去传染和 RDS，并在不依赖于 RDS 的才会进行时人才。在传染后 72 足足用荧光芝酶监测传染传染的组胺。未传染细胞会和 SARS-CoV-2-luc 传染但未经过 RDS 疗法的细胞会作为对照。试验车中所反复三次。绘所示静脉注射化学反应曲面和 RDS 的 I-C50 挥发比例为 1:230。CRDS 对 VeroE6 细胞会的细胞会疗效也通过氯化丙啶上色和流结构设计细胞会拳法一原理。用 RDS 同年份挥发 4 足足，洗涤去 RDS，在不内含 RDS 的才会人才 72 足足。绘所示细胞会疗效静脉注射-化学反应曲面，RDS 的半窒息硫酸度 (LC50) 比例为 1:13.8 挥发。DRDS 抑制传染特质 SARS-CoV-2 传染。用同年份挥发的 RDS 函数调用 VeroE6 细胞会，并在 RDS 依赖于的才会传染 SARS-CoV-2。传染 48 足足后，通过暴菌斑归纳传染被囚后的传染复制抑制上述情况。抑制试验车一结构设计三份进行时，并在 Prism7(Graph Pad) 中所应用于单向方差 (One-Way ANOVA) 归纳及 Dunnett 后筛选 (Dunnett's Post Test)，更进一步已确定统计显着特质。显著特质绝对值用所示例回应如下：*p
为了更进一步测试应用于假传染赢得的结果，我们试验车了 RDS 对于 SARS-CoV-2 传染的堵塞传染特质能够。如所示 3D 右所示，RDS 同时也堵塞了 SARS-CoV-2 对 VeroE6 细胞会的传染。RDS 在挥发 1:40 以上时可显著请于大传染黄褐色的过渡到。
综上，通过 SARS-CoV-2 假传染与传染特质传染的得出，RDS 成分抑制 SARS-CoV-2 传染的能活特质结合物，意味著是通过反之亦然灭能活传染或堵塞传染的一时期传染延迟。
为更进一步学术研究意味著的必要，我们将传染特质 SARS-CoV-2 传染微粒与同年份挥发的 RDS 在 37°C 下预人才 1 足足。随后，将的大醇更进一步依序挥发-(10–1 至 10–4)，并申请加入 Vero 细胞会进行时暴菌斑归纳以已确定传染传染特质的减小。如所示 4A 右所示，我们辨别到在 RDS 中所短暂去除一足足后的传染微粒，其 SARS-CoV-2 的传染效价也圆形静脉注射抑制下降。该结果声称了 RDS 可必要反之亦然灭能活 SARS-CoV-2 传染微粒的传染特质。
我们更进一步试验车了 RDS 到底也能抑制 SARS-CoV-2 传染兰花的传染。为此，我们利用最近开发的结合的大传染-SARS-CoV-2 假型传染 (Ha-CoV-2)[31] 来氢化一第四部 S 亚基例外，特别联爱尔兰例外 (B.1.1.7)，津巴布韦例外 (B.1.351)，哥伦比亚例外 (P.1)，加州例外 (B.1.429)，和其他几个最初兴例外 (B.1.2，B.1.494，B.1.1.207B.1.258，B.1.1.298)。Ha-CoV-2(Luc) 和特别 S 亚基变异体在 37°C 同年份挥发 RDS 人才 1 足足。随后，用该的大醇传染 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 生物膜会。传染后 12 足足，荧光芝酶测量传染传染的组胺。如所示 4B 右所示，我们还辨别到了 RDS 对 Ha-CoV-2(Luc) 和所有 S 亚基例外的静脉注射抑制抑制。
我们还试验车了 RDS 堵塞 SARS-CoV 传染的能够，应用于带有 SARS-CoV 突刺亚基的 GFP 报道基因快传染和[15] 实为静脉注射。我们将人 A549(ACE2) 细胞会用作生物膜会，将其用第四部挥发的 RDS 函数调用，然后用 SARS-CoV(GFP) 报告基因假传染传染 4-6 足足。传染后在不内含 RDS 的才会人才细胞会，流结构设计细胞会拳法举例来说监测其对传染传染的组胺。举例来说，应用于氯化丙啶也就是说正试图致死与已致死的细胞会，均在能活细胞会群中所归纳 GFP+细胞会。如所示 5A 右所示，我们辨别到 RDS 对 SARS-CoV(GFP) 假型传染的组胺圆形静脉注射抑制。我们更进一步声称了这些结果，并举例来说了 RDS 介导的抑制与 Luc 报道基因 SARS-CoV 假型传染，SARSCoV(Luc)。我们辨别到 RDS 对 SARS-CoV(Luc) 和的组胺圆形静脉注射特质依赖，其半抑制硫酸度 (IC50) 为 1:70.88 挥发度 (所示 5B，C)。毕竟 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都应用于 ACE2 传染生物膜会，我们还试验车了 RDS 的炎传染能活特质到底均针对与 ACE2 有相互发挥作用的冠状传染。为此，我们监测了一种不特别的负链 RNA 传染--丙型风行特质感冒传染。它通过传染血凝芝 (HA) 和细胞会α-唾液硫酸来传染生物膜会。为了氢化丙型风行特质感冒传染，将解读丙型风行特质感冒 A/WSN/33(H1N1) 基因组每个片段的 8 个多肽和一个 GFP-报道基因一共转染到 HEK293T 细胞会中所。在 RDS 依赖于的才会，搜集传染微粒他用做传染目标 MDCK 细胞会。如所示 6A 右所示，我们辨别到 RDS 对丙型风行特质感冒传染的组胺圆形静脉注射抑制。RDS 在 1:40 和 1:80 挥发时可完全堵塞传染传染，在 1:160 挥发时则可以外抑制丙型风行特质感冒。RDS 对 MDCK 细胞会的半窒息硫酸度 (LC50) 经测量为 1:18.5(所示 6B)。这些得出，RDS 的炎传染能活特质并非针对特定传染，而意味著尽意味著尤其抑制多种黏膜传染，如冠状传染和丙型风行特质感冒传染。
▋争论
在本报告中所，我们断定了传统习俗抑静脉注射破除肺毒静脉注射液 (RDS) 成分广谱炎传染能活特质，可堵塞 SARS-CoV、SARSCoV-2 和丙型风行特质感冒传染的传染。虽然 RDS 尽意味著抑制多种传染，但其炎传染能活特质因传染类型和毒株而异。例如，对 SARS-CoV 快假传染的 I-C50 硫酸度为 1:7.9 挥发度，对 SARS-CoV-2 快假传染的 I-C50 硫酸度为 1:230 挥发度。对于传染特质野生型 SARS-CoV-2 传染，I-C50 为 1:40 挥发度，对丙型风行特质感冒，其 I-C50 为 1:250。RDS 对 Ha-CoV-2 及其兰花有多种不同的组胺，IC50 误差从 1:70 到 1:2601 挥发度平均 (所示 4B)。
(可知下一页所示)
所示 4 RDS 对 SARS-CoV-2 和相异的 Ha-CoV-2 兰花不具备静脉注射抑制灭能活发挥作用。ASARS-CoV-2 微粒加同年份挥发的 RDS 在 37°C 下人才 1 足足。随后，将的大醇更进一步同年份挥发，并申请加入 Vero 细胞会中所进行时暴菌斑归纳，以已确定传染传染特质减小。抑制试验车一结构设计三份进行时，并在 Prism7(GraphPad) 中所应用于单向方差 (One-WayANOVA) 归纳和 Dunnett 后筛选 (Dunnett'sPostTest) 更进一步已确定统计显着特质。显著特质绝对值用所示例回应如下：*p
BHa-CoV-2(Luc) 和特别 S 亚基例外与同年份挥发的 RDS 在 37°C 人才 1 足足后，用的大醇传染 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 生物膜会。传染后 12 足足，荧光芝酶测量传染传染的组胺。RDS 的 IC50 绝对值的挥发度为 1:177(wt)，1:828(B.1.1.7)，1:124(B.1.351)，1:88(P.1)，1:134(B.1.1.207)，1:2601(B.1.1.298)，1:70(B.1.258)，1:362(B.1.429)，1:163(B.1.494)，1:137(B.1.2)。
我们更进一步断定了 RDS 可以抑制冠状传染的一时期传染延迟。虽然具体的炎传染必要尚未可信，但 RDS 可以通过反之亦然灭能活传染微粒或通过阻挠传染侵入或堵塞传染侵入后的一时期延迟来阻挠传染传染。在其他几种传统习俗中所药中所也找到了炎 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的能活特质。例如，一种常可知的传统习俗中所药——生姜。
生姜根中所已断定成分生姜硫酸芝，其会 SARS 传染[32] 临床研究分立株的复制。此外，另一种可用做疗法黏膜疾眼疾的中所药——双黄连静脉注射，已辨识显现出在粘液以静脉注射抑制方结构设计抑制 SARS-CoV-23CL 亚基酶 (3CLpro) 能活特质。冬青氨酸和冬青芝拟作为双黄连堵塞 3CLpro[33] 的必要结合物。
所示 5 RDS 抑制 SARS-CoV 假型传染对 A549(ACE2) 细胞会的传染。用同年份挥发的 RDS 函数调用 A、B 细胞会，用 SARS-CoV(GFP)(A) 或 SARSCoV(Luc)B 假型传染传染。将细胞会除去，去掉传染和 RDS，在不依赖于 RDS 的才会进行时人才。在传染后 48 足足和 72 足足，通过流结构设计细胞会拳法或荧光芝酶监测来一原理传染传染的组胺。试验车中所反复三次。绘所示静脉注射作出反应曲面，并绘所示 RDS 的 IC50 绝对值为 1:70.9 挥发度 (C)
所示 6 RDS 抑制的大流传染对 MDCK 细胞会的传染。(A) 用同年份挥发的 RDS 函数调用 MDCK 细胞会 30 分钟，然后用的大流传染 (GFP) 对其进行时传染。传染后，在 RDS 依赖于下人才细胞会。36 足足后用流结构设计细胞会祯对传染传染的组胺进行时一原理。把未传染的细胞会与被的大流传染 (GFP) 传染但未经 RDS 两处理的细胞会进行时对比。所示中所辨识了 GFP+细胞会的百分比。PI 回应氯化丙啶 PI。
(B) 另外还应用于了 MTT 测量法一原理了 RDS 对 MDCK 细胞会的疗效，绘所示了细胞会疗效的静脉注射-化学反应曲面，经计算，RDS 的半数窒息硫酸度为 1:18.5 挥发度 RDS 的必要炎传染结合物尚未已确定。然而，RDS 多种不同于冬青氨酸和冬青芝，RDS 可以通过反之亦然灭能活传染带电粒子来堵塞传染传染 (所示 4)，而冬青氨酸和冬青芝则在传染生命周期的后期通过堵塞传染亚基酶的能活特质来发挥发挥作用。然而，RDS 的粘液炎 SARS-CoV-2 能活特质仍必需在今后的动物学术研究和生命临床研究试验车中所取得声称。迄今为止，我们正试图进行时小型动物试验车中所，以已确定 RDS 在体内堵塞 SARS-CoV-2 传染传染的发展前景。
▋正确特质
我们的学术研究表明，RDS 可尤其抑制黏膜传染的传染，如 SARS-CoV、SARS-CoV-2 和丙型风行特质感冒。
▋最初方法
细胞会和细胞会人才
HEK293T (ATCC 佩拉格鲁，弗吉尼亚) MDCK (ATCC 佩拉格鲁，弗吉尼亚)，VeroE6 (ATCC 佩拉格鲁，弗吉尼亚) 和 A549 (ACE2) (来自 Virongy LLC 赠予，佩拉格鲁，弗吉尼亚)，和 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) (来自 Virongy LLC 赠予，佩拉格鲁，弗吉尼亚) 迄今为止保存于 Dulbecco's modifiedEagle's medium (DMEM) (赛默飞世尔新材料 Thermo Fisher Scientific) 成分 10% 热灭能活 FBS 和 1×氯霉芝-瓦克斯曼 (赛默飞世尔新材料 Thermo Fisher Scientific)。在 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞会基质中所分别以 1μg/ml 和 200μg/ml 的硫酸度申请加入嘌呤霉芝和潮霉芝 B。
核糖体转染和传染氢化
内含 SARS-CoVS 亚基或 SARS-CoV-2S 亚基的快特质假型传染微粒由 Virongy LLC (Manassas，VA) 发放，或按照上去叙述的最初方法[15] 氢化。简言之，为了氢化 GFP 报道基因快特质假传染，HEK293T 细胞会与解读 SARS-CoVS 亚基或 SARS-CoV-2S 亚基的多肽、pCMVΔR8.2 和 pLKO.1-puro-TurboGFP 一共转染。为了产显现出荧光芝酶报道基因快特质假型传染，将 HEK293T 细胞会与解读 SARSCoVS 亚基或 SARS-CoV-2S 亚基的多肽、pCMVΔR8.2 和 pLTR-Tat-IRES-Luc 进行时一共转染。转染后 48 足足搜集传染上清液，离心浓缩，−80℃ 保存。野生型 SARS-CoV-2 传染 (Isolate USA-WA1/2020) 由 BEI Bioresources (Manassas，VA) 发放。pHW-NAGFP (ΔAT6) 报告基因核糖体和 A/WSN/1933 H1N1 相异核糖体 pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-HA、pHW2000-NP、pHW2000-NA、pHW20000M 由 FengLi 指导教授友好发放。在风行特质感冒传染 A-GFP 报道基因带电粒子氢化中所，将 pHW2000-pb2、pHW2000-pb1、pHW2000-PA、pHW2000-ha、pHW2000-np、pHW2000-na、pHW2000-m、pHW2000-ns 和 pHW-NA-GFP 一共转染 HEK293T 细胞会 (ΔAT6)。48 足足后搜集传染上清液。SARS-CoV-2S、M、E、N 解读多肽购自 Sinobiological。利用 Twist Bioscience 合成了 Ha-CoV-2(Luc) 多肽和 S 亚基变异多肽。Ha-CoV-2(Luc) 和 S 亚基变异带电粒子按照上去叙述最初方法[31] 进行时氢化。
传染传染和抑静脉注射抑制试验车
RDS(破除肺毒静脉注射液)(来自 Dejia Harmony 赠予，利斯堡，弗吉尼亚) 是由两匹指导教授试验车中所室 (Burnaby，BC，Canada) 生产的一种娱乐业产品。RDS 中所所有中所精油结合物均相一致《中所国国家标准 2015 年版》「饮片」标准，包成分效结合物内浓度及重金属下、农药纪念版监测。RDS 是一种中所药的一共煎剂，先度中间体在氢气前提下蒸发。SARS-CoV-2 炎血清由 LanceA. Liotta 药剂师发放。将的卡朵尔盐硫酸盐 (Sigma) 重最初水或在二的大基亚砜 (Sigma) 中所。对于假型传染传染，12 孔板中所的 A549(ACE2) 细胞会 (来自 Virongy LLC 赠予，佩拉格鲁，弗吉尼亚) 或 VeroE6 细胞会用 RDS 函数调用 30 分钟，在 37℃ 下传染 4-6 足足，然后在最初鲜基质中所温水人才 48-72 足足。对于 VeroE6 细胞会的传染，细胞会也被 CoV-2 假型传染传染请于强剂 (CoV-2PIE) (来自 Virongy LLC 赠予，佩拉格鲁，弗吉尼亚) 函数调用后，在 37°C 下先两处理 30 分钟。应用于 GloMaxDiscover 酶标祯 (Promega) 归纳细胞会裂解物的荧光芝酶能活特质。对于野生型 SARS-CoV-2 传染，VeroE6 细胞会在 37°C 下用 RDS 函数调用 30 分钟，然后用 MOI 为 0.05 传染 SARS-CoV-2 (Isolate USA-WA1/2020；BEI Bioresources) 在皮特里德的大学的 BSL-3 收容服务设施内停留 1 足足。细胞会用 PBS 温水 2 次，用内含 RDS 的基质人才 48 足足。从上清中所提取传染，用 12 孔板人才的 Vero 细胞会单层中所的暴菌斑试验车测量小瓶滴度。简言之，每个容器在基本的 Dul-becco's ModifiedEagle 基质 (VWR) 中所氢化，特别联 1X 氯霉芝-瓦克斯曼 (VWR)，并替换成 10% 的 FBS(赛默飞世尔新材料 Thermo Fisher Scientific)。然后将 200 微升的每种挥发液吸附到 VeroE6 细胞会单层的三个分岔孔上 1 足足。然后用 1～2 ml0.6% 琼脂糖 (Invitrogen) 和一以外基本的 Eagle Minimal Essential 基质 (VWR) 的的大醇覆盖单层，内含 1X 氯霉芝-瓦克斯曼，并替换成 10%FBS。48 足足后，将单层膜单独在 10% 的大醛盐酸中所 1 足足，并去除覆盖的琼脂塞。为了上色黄褐色，申请加入成分 20% 乙酰的 1% 固体紫上色盐酸 5 分钟，然后用去离子水温水。对于丙型风行特质感冒传染传染 MDCK 细胞会，在 37°C 下用 RDS 函数调用 30 分钟，然后用 A-GFP 报道基因传染传染 6 足足。用内含 RDS 的基质温水细胞会，人才 36 足足。GFP 解读通过流结构设计细胞会祯一原理。(FACSCalibur，BD Biosciences).
对于 SARS-CoV-2 传染微粒的 RDS 灭能活试验车，将 100μl 同年份挥发的 RDS 替换成到 1 mlSARS-CoV-2 传染原液 (3.65×105PFU/ml) 中所，先度 RDS 挥发为 1:20，1:40 或 1:80。也特别联对照前提 (1 ml 传染+100μl 基质)。的大醇在 37°C 下人才 1 足足。随后，对的大醇进行时第四部挥发以激发额外的 1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000 挥发度，并将同年份挥发的容器申请加入 12 孔板中所的 Vero 细胞会中所，用做进行时暴菌斑测量归纳。黄褐色测量中所先度的 RDS 挥发度为 1:200 至 1:200,000；1:400 到 1:400,000；和 1:800 到 1:800,000 的 RDS 挥发液。
Ha-CoV-2(Luc) 和 S 亚基变异带电粒子按照上去叙述的最初方法[31] 氢化。对于 Ha-CoV-2(Luc) 的 RDS 灭能活，将 5μl 同年份挥发的 RDS 替换成到 45μlHa-CoV-2(Luc) 或例外中所，先度 RDS 挥发度为 1:20、1:40、1:80、1:160 或 1:320。将的大醇在 37°C 下人才 1 足足，然后在 RDS 依赖于下传染 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞会 12 足足。应用于 GloMax Discover 酶标祯 (Promega) 归纳细胞会裂解物的荧光芝酶能活特质。
细胞会疗效归纳监测
用氯化丙啶上色和流结构设计细胞会拳法举例来说对 A549 (ACE2) 细胞会和 VeroE6 细胞会的抑静脉注射细胞会疗效进行时监测，如所述 (34)。应用于细胞会请于殖试剂盒 I(MTT) (Sigma) 和制造商建言的方案对 MDCK 细胞会的抑静脉注射疗效进行时举例来说。简言之，将 MDCK 细胞会 (ATCC) 以每孔 1×-105 个细胞会的速度接种到 12 孔板中所。细胞会人才隔夜后，通过 RDS 两处理 1 天，然后在 MTT 标记试剂 (Sigma) 的基质中所人才。将细胞会与标记试剂一共同人才 4 足足，先后续申请加入 MTT 请于盐酸。人才皿孵育住两处，用 GloMax Discover 酶标祯 (Promega) 测量吸光度。
缩写
SARS-CoV：导致急特质消化道特质疾眼疾特别冠状传染；SARSCoV-2：Severe 导致急特质消化道特质疾眼疾特别冠状传染-2；TCM：传统习俗中所药；RDS：黏膜摄入静脉注射液；Ha-CoV-2：结合丙型最初冠传染假传染。
祝贺
致谢 FengLi 发放风行特质感冒传染解读多肽，致谢 LanceLiotta 发放炎毒血清；致谢 TedCi，HeSun，ZhigangGao，WanyingWu 的争论与建言；致谢 KevinCarter、MarkMamdar、RichKeurajian、KarenFreidouni 发放 RDS 和精油杀菌剂。
写作者贡献
此次试验车中所由 Y.W.，R.H. 和 L.A.H. 其设计，由 Y.W. 撰稿，由 L.A.H. 撰稿人。B.H.，D.Y.，A.A.O.，L.D.C.，S.H.，D.D、GA 及 YM 分派了该试验车中所。所有写作者已阅读并审批先度原稿。
资金不足
本学术研究的拨款来自于皮特里德的大学之外拨款 223741(DeJiaHarmony/Anti-SARS-CoV-2)，该款项由德佳和畅 (DeJiaHarmony) 发放。
数据集和材料的安全特质
本学术研究中所激发或归纳的所有数据集均特别联在本文中所。试剂可从 Y.W 两处获取。
单方面
审批及参予同意
不一般来说
同意显现出版
不一般来说
竞争权益
皮特里德的大学国际组织生物防御和传染眼疾该中所心的 RMH 和 YW 已赢得了德佳和畅 (DejiaHarmony) 的学术研究资助，LAH 为德佳和畅担任顾问并赢得了雇请。并未其他人关系或能活动意味著会影响到提交的临时工。
写作者查看
1澳大利亚弗吉尼亚皮特里德的大学生物化学学院国际组织生物防御和传染眼疾该中所心，佩拉格鲁 20110。
2VirongyLLC，弗吉尼亚佩拉格鲁。3纽西兰伯纳比，BCV5J0E5 两匹指导教授试验车中所室 (Dr.Ma's LaboratoriesInc.)。4 澳大利亚弗吉尼亚利斯堡订为社会科学组织，20176。
收稿年份：2021 年 4 同年 7 日
接受年份：2021 年 5 同年 10 日
线上显现出版时间：2021 年 5 同年 29 日
引文
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撰稿人： 翟；也男相关新闻
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